Team:Jilin China/RESULT

The experimental scheme

1、The amino acid sequence of the protein

MlrA GenBank: AF411068 SOURCE  Sphingomonas sp. ACM-3962

MREFVRQRPLLCFYVLAILIALAAHALRAMSPTPLDPMFKMLQETHAHLNIITAVRSTFEYPGAYTLLLFPAAPMFAALIATGIGYGQAGFRELLSRCAPWRSPVSWRQGVTVIAVCFLAFFALTGIMWVQTYLYAPPGTLDRTFLRYGSDPVAIYVMLAASLLLSPGPLLEELGWRGFALPQLLKKFDPLTAAVILGIMWWAWHLPRDLPTLFSGAPGAAWSVIVKQLVITPGFIASTIIAVFVCNKLGGSMWGGVLTHAIHNELGVNVTAEWAPTVAGLGWRPWDLIEFAVAIGLVLICGRSLGAASPDNARLAWGNVPPKLPGGVGDKSGANA

2、The selection of codons

Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 [gbbct]: 2504 CDS's (696252 codons)

http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=272622

fields: [triplet] [frequency: per thousand] ([number])

UUU 36.1( 25117)  UCU 16.5( 11473)  UAU 28.4( 19782)  UGU  3.9(  2729)

UUC 12.0(  8326)  UCC  3.3(  2266)  UAC  8.1(  5665)  UGC  1.1(   771)

UUA 31.0( 21599)  UCA 21.1( 14698)  UAA  2.5(  1708)  UGA  0.7(   498)

UUG 21.2( 14782)  UCG  3.9(  2685)  UAG  0.4(   298)  UGG 10.1(  7000)

CUU 25.2( 17574)  CCU 11.9(  8253)  CAU 13.3(  9269)  CGU 14.6( 10159)

CUC  8.1(  5614)  CCC  2.9(  1990)  CAC  4.5(  3121)  CGC  4.5(  3122)

CUA  8.0(  5591)  CCA 14.5( 10061)  CAA 31.1( 21678)  CGA  5.9(  4140)

CUG  6.4(  4476)  CCG  2.9(  2010)  CAG  6.6(  4596)  CGG  2.3(  1570)

AUU 51.0( 35505)  ACU 20.4( 14218)  AAU 40.1( 27903)  AGU 14.7( 10220)

AUC 16.1( 11197)  ACC  7.4(  5135)  AAC 11.1(  7709)  AGC  6.2(  4328)

AUA  8.7(  6023)  ACA 22.1( 15386)  AAA 61.2( 42611)  AGA  8.0(  5557)

AUG 24.7( 17203)  ACG  7.1(  4919)  AAG 13.5(  9375)  AGG  1.7(  1152)

GUU 30.8( 21415)  GCU 30.1( 20949)  GAU 37.3( 25965)  GGU 23.4( 16287)

GUC 12.7(  8841)  GCC 12.1(  8400)  GAC 14.4( 10018)  GGC  8.5(  5906)

GUA 12.8(  8921)  GCA 22.3( 15521)  GAA 56.1( 39035)  GGA 24.5( 17046)

GUG  9.2(  6376)  GCG  8.2(  5708)  GAG 13.0(  9070)  GGG  8.2(  5732)

Coding GC 36.75% 1st letter GC 48.61% 2nd letter GC 34.45% 3rd letter GC 27.20%

The codon table used

* TAA 

A GCT

C TGT

D GAT

E GAA

F TTT

G GGA

H CAT

I ATT

K AAA

L TTA

M ATG

N AAT

P CCA

Q CAA

R CGA

S TCA

T ACT

V GTT

W TGG

Y TAT

3、The inverse translation sequences and the selection of restriction enzymes

EcoR I

CCGGAATTCATGCGAGAATTTGTTCGACAACGACCATTATTATGTTTTTATGTTTTAGCTATTTTAATTGCTTTAGCTGCTCATGCTTTACGAGCTATGTCACCAACTCCATTAGATCCAATGTTTAAAATGTTACAAGAAACTCATGCTCATTTAAATATTATTACTGCTGTTCGATCAACTTTTGAATATCCAGGAGCTTATACTTTATTATTATTTCCAGCTGCTCCAATGTTTGCTGCTTTAATTGCTACTGGAATTGGATATGGACAAGCTGGATTTCGAGAATTATTATCACGATGTGCTCCATGGCGATCACCAGTTTCATGGCGACAAGGAGTTACTGTTATTGCTGTTTGTTTTTTAGCTTTTTTTGCTTTAACTGGAATTATGTGGGTTCAAACTTATTTATATGCTCCACCAGGAACTTTAGATCGAACTTTTTTACGATATGGATCAGATCCAGTTGCTATTTATGTTATGTTAGCTGCTTCATTATTATTATCACCAGGACCATTATTAGAAGAATTAGGATGGCGAGGATTTGCTTTACCACAATTATTAAAAAAATTTGATCCATTAACTGCTGCTGTTATTTTAGGAATTATGTGGTGGGCTTGGCATTTACCACGAGATTTACCAACTTTATTTTCAGGAGCTCCAGGAGCTGCTTGGTCAGTTATTGTTAAACAATTAGTTATTACTCCAGGATTTATTGCTTCAACTATTATTGCTGTTTTTGTTTGTAATAAATTAGGAGGATCAATGTGGGGAGGAGTTTTAACTCATGCTATTCATAATGAATTAGGAGTTAATGTTACTGCTGAATGGGCTCCAACTGTTGCTGGATTAGGATGGCGACCATGGGATTTAATTGAATTTGCTGTTGCTATTGGATTAGTTTTAATTTGTGGACGATCATTAGGAGCTGCTTCACCAGATAATGCTCGATTAGCTTGGGGAAATGTTCCACCAAAATTACCAGGAGGAGTTGGAGATAAATCAGGAGCTAATGCTTAATAGCTGCAGTT

4、The sequence analysis

_Base Count : 1008 bp (270 A, 377 T, 158 C, 203 G)
 _Composition : 36% GC, 64% AT

Absent Sites
AarI AatII Acc65I AccI AciI AclI AcuI AfeI AflII AflIII AgeI AhdI AleI ApaI ApaLI AscI AseI AsiSI AsuII AvaI AvrII BaeGI BamHI BanI BbsI BbvCI BceAI BciVI BclI BfaI BfuAI BglI BglII BlpI BmgBI BmrI BmtI Bpu10I BpuEI BsaAI BsaHI BsaI BsaWI BseMII BseYI BsgI BsiEI BsiWI BslI BsmAI BsmBI BsmFI BsmI BsoBI BspCNI BspEI BspHI BspMI BspQI BsrBI BsrDI BsrFI BsrGI BssHII BstAPI BstBI BstEII BstUI BstZ17I Bsu36I BtgZI BtrI BtsI Cac8I ClaI CviQI DdeI DrdI EaeI EagI EarI EciI Eco31I EcoNI EcoO109I EcoRI EcoRV Esp3I FauI FseI FspAI FspI HaeII HaeIII HgaI HhaI HinP1I HincII HindIII HinfI HpaI HpaII Hpy99I HpyAV HpyCH4IV HpyCH4V KasI KpnI MaeI MaeII MfeI MluI MlyI MscI NaeI NarI NciI NdeI NgoMIV NheI NmeAIII NotI NruI NsiI NspI PacI PasI PciI PflFI PflMI PleI PmeI PpuMI PshAI PsiI PspOMI PspXI PstI PvuI RsaI RsrII SacII SalI SanDI SbfI ScaI SexAI SfaNI SfcI SfiI SfoI SgrAI SmaI SmlI SnaBI SpeI SphI SrfI StuI TaiI TatI TauI TfiI TspGWI TspMI TspRI Tth111I XbaI XhoI XmaI ZraI

Unique Sites

XmnI (6) MslI (25)

Tsp45I (89)

SwaI (142) SspI (147)

MspA1I (211)

DraIII (286)

BstXI (309)

BsaBI (439) Hpy188I (447)

Sau96I (501)

MboII (513)

BssSI (619)

SacI (646) XcmI (651) AlwNI (652)

NlaIV (821)

Hpy166II (901)

5、Sequence Split

The maximum allowable assembly oligo length is equal to the target assembly oligo length (60). This may cause some weird behavior, especially in terms of overlap melting temperature.

2 building blocks were generated.

Building Block .1   529bp   1..529 
Left  - 5' CCGGAATTCATGCGAGAATTTGTTCG 3'
Rght  - 5' ATTCTTCTAATAATGGTCCTGGTGATAATAATAATGAAG 3'
RghtU - 5' ATTCTTCTAAUAATGGTCCTGGTGATAATAATAATGAAG 3'
Sequence:

CCGGAATTCATGCGAGAATTTGTTCGACAACGACCATTATTATGTTTTTATGTTTTAGCTATTTTAATTGCTTTAGCTGCTCATGCTTTACGAGCTATGTCACCAACTCCATTAGATCCAATGTTTAAAATGTTACAAGAAACTCATGCTCATTTAAATATTATTACTGCTGTTCGATCAACTTTTGAATATCCAGGAGCTTATACTTTATTATTATTTCCAGCTGCTCCAATGTTTGCTGCTTTAATTGCTACTGGAATTGGATATGGACAAGCTGGATTTCGAGAATTATTATCACGATGTGCTCCATGGCGATCACCAGTTTCATGGCGACAAGGAGTTACTGTTATTGCTGTTTGTTTTTTAGCTTTTTTTGCTTTAACTGGAATTATGTGGGTTCAAACTTATTTATATGCTCCACCAGGAACTTTAGATCGAACTTTTTTACGATATGGATCAGATCCAGTTGCTATTTATGTTATGTTAGCTGCTTCATTATTATTATCACCAGGACCATTATTAGAAGAAT

Assembly Oligos: average overlap Tm is 47°;average oligo length is 58bp.

CCGGAATTCATGCGAGAATTTGTTCGACAACGACCATTATTATGTTTTTATGTTTTAGCTATTTTAATTGCTTTAGCTGCTCATGCTTTACGAGCTATGTCACCAACTCCATTAGATCCAATGTTTAAAATGTTACAAGAAACTCATGCTCATTTAAATATTATTACTGCTGTTCGATCAACTTTTGAATATCCAGGAGCTTATACTTTATTATTATTTCCAGCTGCTCCAATGTTTGCTGCTTTAATTGCTACTGGAATTGGATATGGACAAGCTGGATTTCGAGAATTATTATCACGATGTGCTCCATGGCGATCACCAGTTTCATGGCGACAAGGAGTTACTGTTATTGCTGTTTGTTTTTTAGCTTTTTTTGCTTTAACTGGAATTATGTGGGTTCAAACTTATTTATATGCTCCACCAGGAACTTTAGATCGAACTTTTTTACGATATGGATCAGATCCAGTTGCTATTTATGTTATGTTAGCTGCTTCATTATTATTATCACCAGGACCATTATTAGAAGAAT
CCGGAATTCATGCGAGAATTTGTTCGACAACGACCATTATTATGTTTTTATGTTTTAGCT              AGCTGCTCATGCTTTACGAGCTATGTCACCAACTCCATTAGATCCAATGTTTAAAATGTT              CTCATTTAAATATTATTACTGCTGTTCGATCAACTTTTGAATATCCAGGAGCTTATACTT              GCTGCTCCAATGTTTGCTGCTTTAATTGCTACTGGAATTGGATATGGACAAGCTGGATTT              ACGATGTGCTCCATGGCGATCACCAGTTTCATGGCGACAAGGAGTTACTGTTATTGCTGT               TTTTGCTTTAACTGGAATTATGTGGGTTCAAACTTATTTATATGCTCCACCAGGAACTTT                CGATATGGATCAGATCCAGTTGCTATTTATGTTATGTTAGCTGCTTCATTATTATTATCA                      
                                     ATAATACAAAAATACAAAATCGATAAAATTAACGAAATCGACGAGTACGAAATGCTC                 AATCTAGGTTACAAATTTTACAATGTTCTTTGAGTACGAGTAAATTTATAATAATGACGA              ACTTATAGGTCCTCGAATATGAAATAATAATAAAGGTCGACGAGGTTACAAACGAC                  AACCTATACCTGTTCGACCTAAAGCTCTTAATAATAGTGCTACACGAGGTACCGCT                  GTTCCTCAATGACAATAACGACAAACAAAAAATCGAAAAAAACGAAATTGACCTTAATAC                ATATACGAGGTGGTCCTTGAAATCTAGCTTGAAAAAATGCTATACCTAGTCTAGGTCAAC                TCGACGAAGTAATAATAATAGTGGTCCTGGTAATAATCTTCTTA
GGCCTTAAGTACGCTCTTAAACAAGCTGTTGCTGGTAATAATACAAAAATACAAAATCGATAAAATTAACGAAATCGACGAGTACGAAATGCTCGATACAGTGGTTGAGGTAATCTAGGTTACAAATTTTACAATGTTCTTTGAGTACGAGTAAATTTATAATAATGACGACAAGCTAGTTGAAAACTTATAGGTCCTCGAATATGAAATAATAATAAAGGTCGACGAGGTTACAAACGACGAAATTAACGATGACCTTAACCTATACCTGTTCGACCTAAAGCTCTTAATAATAGTGCTACACGAGGTACCGCTAGTGGTCAAAGTACCGCTGTTCCTCAATGACAATAACGACAAACAAAAAATCGAAAAAAACGAAATTGACCTTAATACACCCAAGTTTGAATAAATATACGAGGTGGTCCTTGAAATCTAGCTTGAAAAAATGCTATACCTAGTCTAGGTCAACGATAAATACAATACAATCGACGAAGTAATAATAATAGTGGTCCTGGTAATAATCTTCTTA 

Building Block .2   513bp   519..1031 
Left  - 5' ATTAGAAGAATTAGGATGGCGAGGATTTGC 3'
LeftU - 5' ATTAGAAGAAUTAGGATGGCGAGGATTTGC 3'
Rght  - 5' AAGACGTCCTATTAAGCATTAGCTCCTG 3'
Sequence:

ATTAGAAGAATTAGGATGGCGAGGATTTGCTTTACCACAATTATTAAAAAAATTTGATCCATTAACTGCTGCTGTTATTTTAGGAATTATGTGGTGGGCTTGGCATTTACCACGAGATTTACCAACTTTATTTTCAGGAGCTCCAGGAGCTGCTTGGTCAGTTATTGTTAAACAATTAGTTATTACTCCAGGATTTATTGCTTCAACTATTATTGCTGTTTTTGTTTGTAATAAATTAGGAGGATCAATGTGGGGAGGAGTTTTAACTCATGCTATTCATAATGAATTAGGAGTTAATGTTACTGCTGAATGGGCTCCAACTGTTGCTGGATTAGGATGGCGACCATGGGATTTAATTGAATTTGCTGTTGCTATTGGATTAGTTTTAATTTGTGGACGATCATTAGGAGCTGCTTCACCAGATAATGCTCGATTAGCTTGGGGAAATGTTCCACCAAAATTACCAGGAGGAGTTGGAGATAAATCAGGAGCTAATGCTTAATAGGACGTCTT

Assembly Oligos: average overlap Tm is 49°;average oligo length is 58bp.

ATTAGAAGAATTAGGATGGCGAGGATTTGCTTTACCACAATTATTAAAAAAATTTGATCCATTAACTGCTGCTGTTATTTTAGGAATTATGTGGTGGGCTTGGCATTTACCACGAGATTTACCAACTTTATTTTCAGGAGCTCCAGGAGCTGCTTGGTCAGTTATTGTTAAACAATTAGTTATTACTCCAGGATTTATTGCTTCAACTATTATTGCTGTTTTTGTTTGTAATAAATTAGGAGGATCAATGTGGGGAGGAGTTTTAACTCATGCTATTCATAATGAATTAGGAGTTAATGTTACTGCTGAATGGGCTCCAACTGTTGCTGGATTAGGATGGCGACCATGGGATTTAATTGAATTTGCTGTTGCTATTGGATTAGTTTTAATTTGTGGACGATCATTAGGAGCTGCTTCACCAGATAATGCTCGATTAGCTTGGGGAAATGTTCCACCAAAATTACCAGGAGGAGTTGGAGATAAATCAGGAGCTAATGCTTAATAGGACGTCTT
ATTAGAAGAATTAGGATGGCGAGGATTTGCTTTACCACAATTATTAAAAAAATTTGATCC            TGTTATTTTAGGAATTATGTGGTGGGCTTGGCATTTACCACGAGATTTACCAACTTTATT            AGGAGCTGCTTGGTCAGTTATTGTTAAACAATTAGTTATTACTCCAGGATTTATTGCTTC            TGTTTTTGTTTGTAATAAATTAGGAGGATCAATGTGGGGAGGAGTTTTAACTCATGC               AGGAGTTAATGTTACTGCTGAATGGGCTCCAACTGTTGCTGGATTAGGATGGCGA                 ATTTGCTGTTGCTATTGGATTAGTTTTAATTTGTGGACGATCATTAGGAGCTGCTTC                TTAGCTTGGGGAAATGTTCCACCAAAATTACCAGGAGGAGTTGGAGATAAATCAGGAGC                     
                                    TGTTAATAATTTTTTTAAACTAGGTAATTGACGACGACAATAAAATCCTTAATACACCAC            TGGTGCTCTAAATGGTTGAAATAAAAGTCCTCGAGGTCCTCGACGAACCAGTCAA                 ATAATGAGGTCCTAAATAACGAAGTTGATAATAACGACAAAAACAAACATTATTTAATCC            CCCTCCTCAAAATTGAGTACGATAAGTATTACTTAATCCTCAATTACAATGACGACTTAC            ACGACCTAATCCTACCGCTGGTACCCTAAATTAACTTAAACGACAACGATAACCTAATCA            TGCTAGTAATCCTCGACGAAGTGGTCTATTACGAGCTAATCGAACCCCTTTACAAGGTG               CTCAACCTCTATTTAGTCCTCGATTACGAATTATCCTGCAGAA
TAATCTTCTTAATCCTACCGCTCCTAAACGAAATGGTGTTAATAATTTTTTTAAACTAGGTAATTGACGACGACAATAAAATCCTTAATACACCACCCGAACCGTAAATGGTGCTCTAAATGGTTGAAATAAAAGTCCTCGAGGTCCTCGACGAACCAGTCAATAACAATTTGTTAATCAATAATGAGGTCCTAAATAACGAAGTTGATAATAACGACAAAAACAAACATTATTTAATCCTCCTAGTTACACCCCTCCTCAAAATTGAGTACGATAAGTATTACTTAATCCTCAATTACAATGACGACTTACCCGAGGTTGACAACGACCTAATCCTACCGCTGGTACCCTAAATTAACTTAAACGACAACGATAACCTAATCAAAATTAAACACCTGCTAGTAATCCTCGACGAAGTGGTCTATTACGAGCTAATCGAACCCCTTTACAAGGTGGTTTTAATGGTCCTCCTCAACCTCTATTTAGTCCTCGATTACGAATTATCCTGCAGAA