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Team:Jilin China/RESULT
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mlrA基因合成
一、实验方案
1、目的蛋白氨基酸序列
MlrA GenBank: AF411068 SOURCE Sphingomonas sp. ACM-3962
MREFVRQRPLLCFYVLAILIALAAHALRAMSPTPLDPMFKMLQETHAHLNIITAVRSTFEYPGAYTLLLFPAAPMFAALIATGIGYGQAGFRELLSRCAPWRSPVSWRQGVTVIAVCFLAFFALTGIMWVQTYLYAPPGTLDRTFLRYGSDPVAIYVMLAASLLLSPGPLLEELGWRGFALPQLLKKFDPLTAAVILGIMWWAWHLPRDLPTLFSGAPGAAWSVIVKQLVITPGFIASTIIAVFVCNKLGGSMWGGVLTHAIHNELGVNVTAEWAPTVAGLGWRPWDLIEFAVAIGLVLICGRSLGAASPDNARLAWGNVPPKLPGGVGDKSGANA
2、密码子选择
Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 [gbbct]: 2504 CDS's (696252 codons)
http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=272622
fields: [triplet] [frequency: per thousand] ([number])
UUU 36.1( 25117) UCU 16.5( 11473) UAU 28.4( 19782) UGU 3.9( 2729)
UUC 12.0( 8326) UCC 3.3( 2266) UAC 8.1( 5665) UGC 1.1( 771)
UUA 31.0( 21599) UCA 21.1( 14698) UAA 2.5( 1708) UGA 0.7( 498)
UUG 21.2( 14782) UCG 3.9( 2685) UAG 0.4( 298) UGG 10.1( 7000)
CUU 25.2( 17574) CCU 11.9( 8253) CAU 13.3( 9269) CGU 14.6( 10159)
CUC 8.1( 5614) CCC 2.9( 1990) CAC 4.5( 3121) CGC 4.5( 3122)
CUA 8.0( 5591) CCA 14.5( 10061) CAA 31.1( 21678) CGA 5.9( 4140)
CUG 6.4( 4476) CCG 2.9( 2010) CAG 6.6( 4596) CGG 2.3( 1570)
AUU 51.0( 35505) ACU 20.4( 14218) AAU 40.1( 27903) AGU 14.7( 10220)
AUC 16.1( 11197) ACC 7.4( 5135) AAC 11.1( 7709) AGC 6.2( 4328)
AUA 8.7( 6023) ACA 22.1( 15386) AAA 61.2( 42611) AGA 8.0( 5557)
AUG 24.7( 17203) ACG 7.1( 4919) AAG 13.5( 9375) AGG 1.7( 1152)
GUU 30.8( 21415) GCU 30.1( 20949) GAU 37.3( 25965) GGU 23.4( 16287)
GUC 12.7( 8841) GCC 12.1( 8400) GAC 14.4( 10018) GGC 8.5( 5906)
GUA 12.8( 8921) GCA 22.3( 15521) GAA 56.1( 39035) GGA 24.5( 17046)
GUG 9.2( 6376) GCG 8.2( 5708) GAG 13.0( 9070) GGG 8.2( 5732)
Coding GC 36.75% 1st letter GC 48.61% 2nd letter GC 34.45% 3rd letter GC 27.20%
密码子密码子密码子
使用密码子表
* TAA
A GCT
C TGT
D GAT
E GAA
F TTT
G GGA
H CAT
I ATT
K AAA
L TTA
M ATG
N AAT
P CCA
Q CAA
R CGA
S TCA
T ACT
V GTT
W TGG
Y TAT
3、逆翻译序列及限制性内切酶选择
EcoR I
CCGGAATTCATGCGAGAATTTGTTCGACAACGACCATTATTATGTTTTTATGTTTTAGCTATTTTAATTGCTTTAGCTGCTCATGCTTTACGAGCTATGTCACCAACTCCATTAGATCCAATGTTTAAAATGTTACAAGAAACTCATGCTCATTTAAATATTATTACTGCTGTTCGATCAACTTTTGAATATCCAGGAGCTTATACTTTATTATTATTTCCAGCTGCTCCAATGTTTGCTGCTTTAATTGCTACTGGAATTGGATATGGACAAGCTGGATTTCGAGAATTATTATCACGATGTGCTCCATGGCGATCACCAGTTTCATGGCGACAAGGAGTTACTGTTATTGCTGTTTGTTTTTTAGCTTTTTTTGCTTTAACTGGAATTATGTGGGTTCAAACTTATTTATATGCTCCACCAGGAACTTTAGATCGAACTTTTTTACGATATGGATCAGATCCAGTTGCTATTTATGTTATGTTAGCTGCTTCATTATTATTATCACCAGGACCATTATTAGAAGAATTAGGATGGCGAGGATTTGCTTTACCACAATTATTAAAAAAATTTGATCCATTAACTGCTGCTGTTATTTTAGGAATTATGTGGTGGGCTTGGCATTTACCACGAGATTTACCAACTTTATTTTCAGGAGCTCCAGGAGCTGCTTGGTCAGTTATTGTTAAACAATTAGTTATTACTCCAGGATTTATTGCTTCAACTATTATTGCTGTTTTTGTTTGTAATAAATTAGGAGGATCAATGTGGGGAGGAGTTTTAACTCATGCTATTCATAATGAATTAGGAGTTAATGTTACTGCTGAATGGGCTCCAACTGTTGCTGGATTAGGATGGCGACCATGGGATTTAATTGAATTTGCTGTTGCTATTGGATTAGTTTTAATTTGTGGACGATCATTAGGAGCTGCTTCACCAGATAATGCTCGATTAGCTTGGGGAAATGTTCCACCAAAATTACCAGGAGGAGTTGGAGATAAATCAGGAGCTAATGCTTAATAGCTGCAGTT
4、序列分析
_Base Count : 1008 bp (270 A, 377 T, 158 C, 203 G)
_Composition : 36% GC, 64% AT
Absent Sites
AarI AatII Acc65I AccI AciI AclI AcuI AfeI AflII AflIII AgeI AhdI AleI ApaI ApaLI AscI AseI AsiSI AsuII AvaI AvrII BaeGI BamHI BanI BbsI BbvCI BceAI BciVI BclI BfaI BfuAI BglI BglII BlpI BmgBI BmrI BmtI Bpu10I BpuEI BsaAI BsaHI BsaI BsaWI BseMII BseYI BsgI BsiEI BsiWI BslI BsmAI BsmBI BsmFI BsmI BsoBI BspCNI BspEI BspHI BspMI BspQI BsrBI BsrDI BsrFI BsrGI BssHII BstAPI BstBI BstEII BstUI BstZ17I Bsu36I BtgZI BtrI BtsI Cac8I ClaI CviQI DdeI DrdI EaeI EagI EarI EciI Eco31I EcoNI EcoO109I EcoRI EcoRV Esp3I FauI FseI FspAI FspI HaeII HaeIII HgaI HhaI HinP1I HincII HindIII HinfI HpaI HpaII Hpy99I HpyAV HpyCH4IV HpyCH4V KasI KpnI MaeI MaeII MfeI MluI MlyI MscI NaeI NarI NciI NdeI NgoMIV NheI NmeAIII NotI NruI NsiI NspI PacI PasI PciI PflFI PflMI PleI PmeI PpuMI PshAI PsiI PspOMI PspXI PstI PvuI RsaI RsrII SacII SalI SanDI SbfI ScaI SexAI SfaNI SfcI SfiI SfoI SgrAI SmaI SmlI SnaBI SpeI SphI SrfI StuI TaiI TatI TauI TfiI TspGWI TspMI TspRI Tth111I XbaI XhoI XmaI ZraI
Unique Sites
XmnI (6) MslI (25)
Tsp45I (89)
SwaI (142) SspI (147)
MspA1I (211)
DraIII (286)
BstXI (309)
BsaBI (439) Hpy188I (447)
Sau96I (501)
MboII (513)
BssSI (619)
SacI (646) XcmI (651) AlwNI (652)
NlaIV (821)
Hpy166II (901)
5、序列拆分
The maximum allowable assembly oligo length is equal to the target assembly oligo length (60). This may cause some weird behavior, especially in terms of overlap melting temperature.
2 building blocks were generated.
Building Block .1 529bp 1..529
Left - 5' CCGGAATTCATGCGAGAATTTGTTCG 3'
Rght - 5' ATTCTTCTAATAATGGTCCTGGTGATAATAATAATGAAG 3'
RghtU - 5' ATTCTTCTAAUAATGGTCCTGGTGATAATAATAATGAAG 3'
Sequence:
CCGGAATTCATGCGAGAATTTGTTCGACAACGACCATTATTATGTTTTTATGTTTTAGCTATTTTAATTGCTTTAGCTGCTCATGCTTTACGAGCTATGTCACCAACTCCATTAGATCCAATGTTTAAAATGTTACAAGAAACTCATGCTCATTTAAATATTATTACTGCTGTTCGATCAACTTTTGAATATCCAGGAGCTTATACTTTATTATTATTTCCAGCTGCTCCAATGTTTGCTGCTTTAATTGCTACTGGAATTGGATATGGACAAGCTGGATTTCGAGAATTATTATCACGATGTGCTCCATGGCGATCACCAGTTTCATGGCGACAAGGAGTTACTGTTATTGCTGTTTGTTTTTTAGCTTTTTTTGCTTTAACTGGAATTATGTGGGTTCAAACTTATTTATATGCTCCACCAGGAACTTTAGATCGAACTTTTTTACGATATGGATCAGATCCAGTTGCTATTTATGTTATGTTAGCTGCTTCATTATTATTATCACCAGGACCATTATTAGAAGAAT
Assembly Oligos: average overlap Tm is 47°;average oligo length is 58bp.
CCGGAATTCATGCGAGAATTTGTTCGACAACGACCATTATTATGTTTTTATGTTTTAGCTATTTTAATTGCTTTAGCTGCTCATGCTTTACGAGCTATGTCACCAACTCCATTAGATCCAATGTTTAAAATGTTACAAGAAACTCATGCTCATTTAAATATTATTACTGCTGTTCGATCAACTTTTGAATATCCAGGAGCTTATACTTTATTATTATTTCCAGCTGCTCCAATGTTTGCTGCTTTAATTGCTACTGGAATTGGATATGGACAAGCTGGATTTCGAGAATTATTATCACGATGTGCTCCATGGCGATCACCAGTTTCATGGCGACAAGGAGTTACTGTTATTGCTGTTTGTTTTTTAGCTTTTTTTGCTTTAACTGGAATTATGTGGGTTCAAACTTATTTATATGCTCCACCAGGAACTTTAGATCGAACTTTTTTACGATATGGATCAGATCCAGTTGCTATTTATGTTATGTTAGCTGCTTCATTATTATTATCACCAGGACCATTATTAGAAGAAT
CCGGAATTCATGCGAGAATTTGTTCGACAACGACCATTATTATGTTTTTATGTTTTAGCT AGCTGCTCATGCTTTACGAGCTATGTCACCAACTCCATTAGATCCAATGTTTAAAATGTT CTCATTTAAATATTATTACTGCTGTTCGATCAACTTTTGAATATCCAGGAGCTTATACTT GCTGCTCCAATGTTTGCTGCTTTAATTGCTACTGGAATTGGATATGGACAAGCTGGATTT ACGATGTGCTCCATGGCGATCACCAGTTTCATGGCGACAAGGAGTTACTGTTATTGCTGT TTTTGCTTTAACTGGAATTATGTGGGTTCAAACTTATTTATATGCTCCACCAGGAACTTT CGATATGGATCAGATCCAGTTGCTATTTATGTTATGTTAGCTGCTTCATTATTATTATCA
ATAATACAAAAATACAAAATCGATAAAATTAACGAAATCGACGAGTACGAAATGCTC AATCTAGGTTACAAATTTTACAATGTTCTTTGAGTACGAGTAAATTTATAATAATGACGA ACTTATAGGTCCTCGAATATGAAATAATAATAAAGGTCGACGAGGTTACAAACGAC AACCTATACCTGTTCGACCTAAAGCTCTTAATAATAGTGCTACACGAGGTACCGCT GTTCCTCAATGACAATAACGACAAACAAAAAATCGAAAAAAACGAAATTGACCTTAATAC ATATACGAGGTGGTCCTTGAAATCTAGCTTGAAAAAATGCTATACCTAGTCTAGGTCAAC TCGACGAAGTAATAATAATAGTGGTCCTGGTAATAATCTTCTTA
GGCCTTAAGTACGCTCTTAAACAAGCTGTTGCTGGTAATAATACAAAAATACAAAATCGATAAAATTAACGAAATCGACGAGTACGAAATGCTCGATACAGTGGTTGAGGTAATCTAGGTTACAAATTTTACAATGTTCTTTGAGTACGAGTAAATTTATAATAATGACGACAAGCTAGTTGAAAACTTATAGGTCCTCGAATATGAAATAATAATAAAGGTCGACGAGGTTACAAACGACGAAATTAACGATGACCTTAACCTATACCTGTTCGACCTAAAGCTCTTAATAATAGTGCTACACGAGGTACCGCTAGTGGTCAAAGTACCGCTGTTCCTCAATGACAATAACGACAAACAAAAAATCGAAAAAAACGAAATTGACCTTAATACACCCAAGTTTGAATAAATATACGAGGTGGTCCTTGAAATCTAGCTTGAAAAAATGCTATACCTAGTCTAGGTCAACGATAAATACAATACAATCGACGAAGTAATAATAATAGTGGTCCTGGTAATAATCTTCTTA
Building Block .2 513bp 519..1031
Left - 5' ATTAGAAGAATTAGGATGGCGAGGATTTGC 3'
LeftU - 5' ATTAGAAGAAUTAGGATGGCGAGGATTTGC 3'
Rght - 5' AAGACGTCCTATTAAGCATTAGCTCCTG 3'
Sequence:
ATTAGAAGAATTAGGATGGCGAGGATTTGCTTTACCACAATTATTAAAAAAATTTGATCCATTAACTGCTGCTGTTATTTTAGGAATTATGTGGTGGGCTTGGCATTTACCACGAGATTTACCAACTTTATTTTCAGGAGCTCCAGGAGCTGCTTGGTCAGTTATTGTTAAACAATTAGTTATTACTCCAGGATTTATTGCTTCAACTATTATTGCTGTTTTTGTTTGTAATAAATTAGGAGGATCAATGTGGGGAGGAGTTTTAACTCATGCTATTCATAATGAATTAGGAGTTAATGTTACTGCTGAATGGGCTCCAACTGTTGCTGGATTAGGATGGCGACCATGGGATTTAATTGAATTTGCTGTTGCTATTGGATTAGTTTTAATTTGTGGACGATCATTAGGAGCTGCTTCACCAGATAATGCTCGATTAGCTTGGGGAAATGTTCCACCAAAATTACCAGGAGGAGTTGGAGATAAATCAGGAGCTAATGCTTAATAGGACGTCTT
Assembly Oligos: average overlap Tm is 49°;average oligo length is 58bp.
ATTAGAAGAATTAGGATGGCGAGGATTTGCTTTACCACAATTATTAAAAAAATTTGATCCATTAACTGCTGCTGTTATTTTAGGAATTATGTGGTGGGCTTGGCATTTACCACGAGATTTACCAACTTTATTTTCAGGAGCTCCAGGAGCTGCTTGGTCAGTTATTGTTAAACAATTAGTTATTACTCCAGGATTTATTGCTTCAACTATTATTGCTGTTTTTGTTTGTAATAAATTAGGAGGATCAATGTGGGGAGGAGTTTTAACTCATGCTATTCATAATGAATTAGGAGTTAATGTTACTGCTGAATGGGCTCCAACTGTTGCTGGATTAGGATGGCGACCATGGGATTTAATTGAATTTGCTGTTGCTATTGGATTAGTTTTAATTTGTGGACGATCATTAGGAGCTGCTTCACCAGATAATGCTCGATTAGCTTGGGGAAATGTTCCACCAAAATTACCAGGAGGAGTTGGAGATAAATCAGGAGCTAATGCTTAATAGGACGTCTT
ATTAGAAGAATTAGGATGGCGAGGATTTGCTTTACCACAATTATTAAAAAAATTTGATCC TGTTATTTTAGGAATTATGTGGTGGGCTTGGCATTTACCACGAGATTTACCAACTTTATT AGGAGCTGCTTGGTCAGTTATTGTTAAACAATTAGTTATTACTCCAGGATTTATTGCTTC TGTTTTTGTTTGTAATAAATTAGGAGGATCAATGTGGGGAGGAGTTTTAACTCATGC AGGAGTTAATGTTACTGCTGAATGGGCTCCAACTGTTGCTGGATTAGGATGGCGA ATTTGCTGTTGCTATTGGATTAGTTTTAATTTGTGGACGATCATTAGGAGCTGCTTC TTAGCTTGGGGAAATGTTCCACCAAAATTACCAGGAGGAGTTGGAGATAAATCAGGAGC
TGTTAATAATTTTTTTAAACTAGGTAATTGACGACGACAATAAAATCCTTAATACACCAC TGGTGCTCTAAATGGTTGAAATAAAAGTCCTCGAGGTCCTCGACGAACCAGTCAA ATAATGAGGTCCTAAATAACGAAGTTGATAATAACGACAAAAACAAACATTATTTAATCC CCCTCCTCAAAATTGAGTACGATAAGTATTACTTAATCCTCAATTACAATGACGACTTAC ACGACCTAATCCTACCGCTGGTACCCTAAATTAACTTAAACGACAACGATAACCTAATCA TGCTAGTAATCCTCGACGAAGTGGTCTATTACGAGCTAATCGAACCCCTTTACAAGGTG CTCAACCTCTATTTAGTCCTCGATTACGAATTATCCTGCAGAA
TAATCTTCTTAATCCTACCGCTCCTAAACGAAATGGTGTTAATAATTTTTTTAAACTAGGTAATTGACGACGACAATAAAATCCTTAATACACCACCCGAACCGTAAATGGTGCTCTAAATGGTTGAAATAAAAGTCCTCGAGGTCCTCGACGAACCAGTCAATAACAATTTGTTAATCAATAATGAGGTCCTAAATAACGAAGTTGATAATAACGACAAAAACAAACATTATTTAATCCTCCTAGTTACACCCCTCCTCAAAATTGAGTACGATAAGTATTACTTAATCCTCAATTACAATGACGACTTACCCGAGGTTGACAACGACCTAATCCTACCGCTGGTACCCTAAATTAACTTAAACGACAACGATAACCTAATCAAAATTAAACACCTGCTAGTAATCCTCGACGAAGTGGTCTATTACGAGCTAATCGAACCCCTTTACAAGGTGGTTTTAATGGTCCTCCTCAACCTCTATTTAGTCCTCGATTACGAATTATCCTGCAGAA
二、实验操作及结果分析
1、引物溶解
根据合成引物的分子量，计算需要添加的灭菌去离子水的量，将合成的引物稀释成10um/L备用。
引物编号 |
Tm |
MW(g/mole) |
nmol/Tube |
Add buffer for 10μM/uL |
A101 |
68.3 |
18451 |
1.6 |
155 |
A102 |
65 |
17588.4 |
1.4 |
142 |
A103 |
69.7 |
18359 |
1.5 |
155 |
A104 |
64.2 |
18533 |
1.4 |
143 |
A105 |
66.3 |
18354 |
1.6 |
155 |
A106 |
68 |
17321.2 |
1.5 |
151 |
A107 |
71.1 |
18533 |
1.6 |
156 |
A108 |
70.9 |
17127.2 |
1.6 |
164 |
A109 |
73.8 |
18513 |
1.6 |
156 |
A110 |
66.3 |
18440 |
1.4 |
137 |
A111 |
67.6 |
18426 |
1.6 |
156 |
A112 |
69.7 |
18506 |
1.5 |
147 |
A113 |
67 |
18441 |
1.6 |
156 |
A114 |
64 |
13568.8 |
2.0 |
200 |
A201 |
66.3 |
18568 |
1.4 |
143 |
A202 |
64.9 |
18407 |
1.5 |
145 |
A203 |
68.3 |
18522 |
1.5 |
155 |
A204 |
71.8 |
16968 |
1.6 |
162 |
A205 |
68.3 |
18491 |
1.5 |
154 |
A206 |
64.9 |
18492 |
1.4 |
138 |
A207 |
67.9 |
17753.4 |
1.6 |
156 |
A208 |
68.3 |
18305 |
1.5 |
151 |
A209 |
72.6 |
17117 |
1.6 |
164 |
A210 |
70.4 |
18278 |
1.5 |
149 |
A211 |
68.6 |
17622.4 |
1.7 |
165 |
A212 |
72.6 |
18145.8 |
1.6 |
156 |
A213 |
71.9 |
18356.8 |
1.5 |
146 |
A214 |
66.9 |
13072.6 |
2.2 |
220 |
A1 |
62 |
8002.2 |
3.6 |
356 |
A2 |
61 |
12043.8 |
2.2 |
222 |
A3 |
62 |
9375 |
2.8 |
281 |
A4 |
62 |
8548.6 |
3.3 |
330 |
A5 |
62 |
8548.6 |
3.3 |
330 |
2、引物混合
合成的寡核苷酸呈粉末状，使用前需要10000rpm离心1min，使寡核苷酸干粉集中在管底，使用时小心开启瓶盖。
溶解寡核苷酸前核对合成报告单与引物标签上的OD数是否一致，并核对分装管数。根据每个引物的合成报告单计算出配制10umol/L浓度的寡核苷酸需要加入水的体积，加入去离子无菌水，室温放置2min，反复振荡助溶，再离心将溶液收集到管底。
每6条引物为一组，首末位引物取4ul，中间引物取1ul，加入新的EP管中，再补充灭菌去离子水至20ul，混匀备用。
组别 |
引物编号 |
吸取量 |
灭菌去离子水添加量 |
总体积 |
每PCR（50ul体系）吸取量 |
终浓度 |
A1 |
A101 |
4 |
8 |
20 |
5ul |
200nM |
A102 |
1 |
50nM |
||||
A103 |
1 |
50nM |
||||
A104 |
1 |
50nM |
||||
A105 |
1 |
50nM |
||||
A106 |
4 |
200nM |
||||
A2 |
A107 |
4 |
8 |
20 |
5ul |
200nM |
A108 |
1 |
50nM |
||||
A109 |
1 |
50nM |
||||
A110 |
1 |
50nM |
||||
A111 |
1 |
50nM |
||||
A112 |
4 |
200nM |
||||
A3 |
A113 |
4 |
8 |
20 |
5ul |
200nM |
A114 |
1 |
50nM |
||||
A201 |
1 |
50nM |
||||
A202 |
1 |
50nM |
||||
A203 |
1 |
50nM |
||||
A204 |
4 |
200nM |
||||
A4 |
A205 |
4 |
8 |
20 |
5ul |
200nM |
A206 |
1 |
50nM |
||||
A207 |
1 |
50nM |
||||
A208 |
1 |
50nM |
||||
A209 |
1 |
50nM |
||||
A210 |
4 |
200nM |
||||
A5 |
A211 |
4 |
10 |
20 |
5ul |
200nM |
A212 |
1 |
50nM |
||||
A213 |
1 |
50nM |
||||
A214 |
4 |
200nM |
